ELISA检测抗体抗原（上）
ELISA检测抗体抗原（上）ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂：
1）固相的抗菌素原或抗体，即"免疫吸附剂 "（immunosorbent）；（2）酶标记的抗原或抗体，称为"结合物"（conjugate）；
3）酶反应的底物。根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件，可设计出各种不同类型的检测方法。用于临床检验的 ELISA主要有以下几种类型：双抗体夹心法测抗原
双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：
1）将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。
2）加受检标本，保温反应。标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。
3） 加酶标抗体，保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。
4）加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。通过比色，测知标本中抗原的量。在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如 HBsAg 、HBeAg、AFP 、hCG 等。只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。如抗体的来源为抗血清，包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物。如应用单克隆抗体，一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗，分别用于包被固相载体和制备酶结合物。这种双位点夹心法具有很高的特异性，而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应，作一步检测。
弱钩状效应。
ELISA检测抗体抗原（上）假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇，例如 HBsAg 的 a 决定簇，也可用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物。但在 HBsAg 的检测中应注意亚型问题，HBs Ag 有 adr、adw、ayr 、ayw4 个亚型，虽然每种亚型均有相同的 a决定簇的反应性，这也是用单抗作夹心法应注意的问题。
双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子（ RF）的干扰。RF 是一种自身抗体，
多为 IgM 型，能和多种动物 IgG 的 Fc 段结合。用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含
有 R F，它可充当抗原成份，同时与固相抗体和酶标抗体结合，表现出假阳性反应。采用 F
（ab'）或 Fab 片段作酶结合物的试剂，由于去除了 Fc 段，从而消除 RF 的干扰。双抗体
夹心法 ELISA 试剂是否受 RF 的影响，已被列为这类试剂的一项考核指标。
双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分
子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。
双抗原夹心法测抗体
反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗 HBs 的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。
ELISA检测抗体抗原（上）间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记的抗抗体（抗人免疫球蛋白抗体）以检测与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下：
1）将特异性抗原与固相载体联结，形成固相抗原。洗涤除去未结合的抗原及杂质。
2）加稀释的受检血清，保温反应。血清中的特异抗体与固相抗原结合，形成固相抗原抗体复
合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体，血清中的其他成份在洗涤过程中被洗去。
3）加酶标抗抗体。可用酶标抗人 Ig 以检测总抗体，但一般多用酶标抗人 IgG 检测 IgG 抗
体。固相免疫复合物中的抗体与酶标抗体抗体结合，从而间接地标记上酶。洗涤后，固相载
体上的酶量与标本中受检抗体的量正相关。
4）加底物显色
本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原
就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。
间接法成功的关键在于抗原的纯度。虽然有时用粗提抗原包被也能取得实际有效的结果，
但应尽可能予以纯化，以提高试验的特异性。特别应注意除去能与一般健康人血清发生反应
的杂质，例如以 E.Coli 为工程酶的重组抗原，如其中含有 E.Coli 成份，很可能与受过 E.Coli
感染者血甭中的抗 E.Coli 抗体发生反应。抗原中也不能含有与酶标抗人 Ig 反应的物质，例如来自人血浆或人体组织的抗原，如不将其中的 Ig去除，试验中也发生假阳性反应。另外如抗原中含有无关蛋白，也会因竟争吸附而影响包被效果。
间接法中另一种干扰因素为正常血清中所含的高浓度的非特异性。病人血清中受检的特异性 IgG 只占总 IgG 中的一小部分。IgG 的吸附性很强，非特异 IgG 可直接吸附到固相载体上，有时也可吸附到包被抗原的表面。因此在间接法中，抗原包被后一般用无关蛋白质（例如牛血清蛋白）再包被一次，以封闭（blocking）固相上的空余间隙。另外，在检测过程中标本须先行稀释ELISA检测抗体抗原（上）（1:40~1:200），以避免过高的阴性本底影响结果的判断。
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