关于印迹亲和纯化方法虽然最初发表出来的方法是使用DTP纸，现在亲和纯化方法已经能很容易地使用硝化纤维膜因为抗体反应可使用比色法测定这种方法具有优势。

1)制备蛋白质混和物或浓缩的抗原制备物的标准S>aS -聚丙烯酞胺凝胶-这被称作:凝胶，全部凝胶只由一种样品组成(例，没有一系列单独的泳道)。

2)使用标准程序把凝胶印到硝化纤维膜或Irninobilon在印迹上用铅笔做定位标记(顶部、底部、边线)供序列分析。

3)在印迹上判明抗原如果抗原是优势带，印迹可用PonceauS染色以判明抗原。

a，把印迹浸在水中约2Q分钟、.

b.把印迹浸在染料中约S分钟，用水简短漂洗。

c.用铅笔做一个小记号以标明抗原带位置。如果抗原是一个复杂的混合物，则用下述常规免疫印迹技术确定它在印迹上的位置。

a.从印迹边缘切下约2~垂直的试验带。

b，用常规免疫印迹方法处理这条带(见本节上述内容)。。通过相关带确定切下的印迹中抗原位置。

4)(用剃刀或解剖刀)切下抗原带并用非特异性蛋白封闭剩余的结合蛋白质位点。也可封闭。

5)把带转人一个小的带盖试管中(如，2一3m1)，并用初级抗体孵化(如，抗血清或血清的域组份)，在室温下至少2小时。孵化可完成，使用一个稍微大点的孵化体积可以使抗原带容易用镊子移动，并且同一个杭体溶液使用3一4次损失很少。

6)用大量的PBS-1%Tween冲洗抗原带3次，每次}U分钟，然后用YBS冲洗2次，句次1D分钟。

7)把抗原带放到一个能装待用洗脱剂的最小体积的容器中。例如，如果抗原带是2-3~宽，1 Dcrn长，使用带单一槽的Acutran孵化盘就很方便(Schteeicher and抗原带可用约。.Sml溶液覆盖，并且洗脱液可以通过倾斜孵化盘倒到另一端而更容易得到回收。用合适洗脱剂处理1一2分钟。

8）用合适洗脱剂处理

9)取出抗原带并立即放人大体积的PBS或TBS中冲洗i5分钟，然后用抗体再次孵化。

10)向洗脱剂中加人10%NGS(或其他适合于次级检测试剂的非特异蛋白)。把杭原带转移到透析袋或透析仪中并在大体积(500ml)的PBS中透析，尽可能快地使抗体中和或恢复到生理状态。

11)对大多数抗原带，在抗原带上的检测损失能够检测出来之前步骤5一9可重复3到4次。可在一天内完成连续洗脱，然后集中用于下一步分析或浓缩。

关于印迹亲和纯化方法疑难解析

本方法中最常见的两个问题是抗原不能从印迹上充分洗脱，或者少量抗体在回收过程中损失掉了。抗体最终产量因为在洗脱和浓缩过程中的损失也许会减少。该方法证明是用最小的努力而获得理想数量的抗体的已有方法中最成功的方法。含有NGS(有助于防止抗体凝集到透析袋上)和快速透析步骤对于形成适合于印染和免疫染色(间接免疫荧光染色，间接免疫金等)的活性抗体是有效的。如果纯化后的抗体需要浓缩，则有方便的方法(硫酸按浓缩，结合蛋白质A，用Centric}n或Amic}on浓缩)。如果膜过滤方法被用于浓缩样品，那么加人的NGS量应减少到防止过滤障碍。