在去除分离的染色质中的大部分细胞质杂质时,将蔗糖和Percoll梯度结合使用是非常有效的。用硅胶悬液形成的密度梯度能使得染色质迁移到与细胞骨架物质分得很开
的位置。
1)在体积为lOml分离得到的染色质物质中加人精胺和精咪至终浓度分别为0.8mmol/L和2mmol/L。
2)加入10ml Percoll溶液,匀浆分离得到的染色质:
可以用制备粗品或从蔗糖和甘油梯度中收集染色体生成Percoll梯度
Percoll溶液
89%(v/ v } Percol}
5mmol/L Tris-HCl (pH7.4)
2mmol/L EDTA
0.8mmol/L精胺
2mmol/L精咪
0.1%毛地黄皂昔
Percoll中需要有聚胺以稳定染色体。
3)再加i5ml Percoil溶液到匀浆中.充分混匀.:
4)将35m1的Peiroll混合物加入50ml的聚碳酸酷离心管中,用一固定角度转头(Beckman Instruments)在20000/min离心30分钟细胞骨架碎片在梯度顶部形成一条带,而染色休在接近梯度底部其浮力密度处形成一清晰的条带
5)吸出染色体带上面的个部物质,将梯度中的染色体回收于大约10ml的PercoII溶液中。
6)为了除去PercoIl颗粒,以1:2比例用稀释缓冲液稀释染色休,1400g离心45分钟进行浓缩稀释缓冲液
5mmol/L Tris-HC1 (pH7.4}
2mmol/L 亚精胺
2mmol/L EDTA
0.8mmol/L精胺
此时可以用稀释缓冲液,己二醇分离缓冲液或含10mmol/L Tris-HCI(ph7.4)水相法缓冲液重悬浮染色体_