甲醇固定前的提取
用变性剂提取细胞并至少保留某些微管及微管蛋白的正常分布是可能的。如果抗体渗透是个问题,或对那些需要半裂解模型的实验来讲这个方法可能有其优点。第1一4步最好在35-mm平皿里用单个盖玻片进行以便提取时间可以被严格控制。
1)用0.1mol/L PIPES(pH6.9)的溶液洗盖玻片。
2)加人含2mol/L甘油和0.4% Triton X-100的0.1mol/L PIPES (pH6.9 )提取缓冲液透化处理细胞1分钟。加这一混合液到细胞里是通过将培养皿倾斜一定角度,然后加人提取缓冲液,再轻轻地将平皿放平。小心提取时间是关健:如果太短,本底会高,如果太长,可能解离并/或微管川能解聚、调整提取时间来确定微管的亚类是否有不同的稳定性银据实验设计,变性刑的作用时间和浓度是可以改变的,如果提取时很短,变性剂的浓度可以减少
3)加入等体积的含1%戊二醛的0.1mol/L PIPES (ph6.9}溶液。进行这一步要使培养
皿倾斜,与已经在平皿里的溶液混合,然后将平皿放平。小心:戊二醛
4)固定10分钟
1)用0.1mol/L PIPES(pH6.9)的溶液洗盖玻片。
2)加人含2mol/L甘油和0.4% Triton X-100的0.1mol/L PIPES (pH6.9 )提取缓冲液透化处理细胞1分钟。加这一混合液到细胞里是通过将培养皿倾斜一定角度,然后加人提取缓冲液,再轻轻地将平皿放平。小心提取时间是关健:如果太短,本底会高,如果太长,可能解离并/或微管川能解聚、调整提取时间来确定微管的亚类是否有不同的稳定性银据实验设计,变性刑的作用时间和浓度是可以改变的,如果提取时很短,变性剂的浓度可以减少
3)加入等体积的含1%戊二醛的0.1mol/L PIPES (ph6.9}溶液。进行这一步要使培养
皿倾斜,与已经在平皿里的溶液混合,然后将平皿放平。小心:戊二醛
4)固定10分钟
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