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总蛋白和膜蛋白提取  

    膜蛋白具有多种功能,在细胞识别、细胞信号转导、运输等有着中着重要的角色,因此也是极佳的药物靶点。抽提膜蛋白主要是进行蛋白组分析:常用的实验是非变性胶电泳、酶活分析、SDS-PAGE、western blot等。

膜蛋白如何提取呢?总蛋白如何抽提呢?

(1)从新鲜样品中提取总蛋白(简易法)

1.  自配裂解液(pH 8.5-9.0):50 mM Tris-HCl,2 mM EDTA , 100 mM NaCl,0.5% Triton X-100,调pH值至8.5-9.0备用;用前加入100 μg/ml 溶菌酶,1 μl/ml 的蛋白酶抑制剂PMSF。该裂解液用量为10-50 ml 裂解液/1 g湿菌体。

2.  将40 ml 菌液在12000 g,4 ℃下离心15分钟收集菌体,沉淀用PBS悬浮洗涤2遍,沉淀加入1 ml裂解液悬浮菌体。

3.  超声粉碎,采用300 w,10 s超声/10 s间隔,超声20 min,反复冻融超声3次至菌液变清或者变色。

4.  1000 g离心去掉大碎片,上清可直接变性后PAGE电泳检测,或者用1% SDS溶液透析后冻存。

缺点:Western blotting结果表明,疏水性跨膜蛋白提取效率有限。

(2)从Trizol裂解液中分离总蛋白

1.  Trizol溶解的样品研磨破碎后,加氯仿分层,2-8 ℃下10000 g离心15 min,上层水相用于RNA提取,体积约为总体积的60%。

2.  用乙醇沉淀中间层和有机相中的DNA。每使用1 ml Trizol加入0.3 ml无水乙醇混匀,室温放置3 min,2-8 ℃不超过2000 g离心5 min。

3.  将上清移至新的EP管中,用异丙醇沉淀蛋白质。每使用1 ml Trizol加入1.5 ml异丙醇,室温放置10 min,2-8 ℃下12000 g离心10 min,弃上清。

4.  用含有0.3 M 盐酸胍的95%乙醇洗涤。每1 ml Trizol加入2 ml洗液,室温放置20 min, 2-8 ℃下7500 g离心5 min,弃上清,重复洗涤2次。最后加入2 ml无水乙醇,涡旋后室温放置20 min,2-8 ℃下7500 g离心5 min,弃上清。

5.  冷冻干燥5-10 min,1%SDS溶液溶解,反复吹打,50 ℃温浴使其完全溶解,2-8 ℃下10000 g离心10 min去除不溶物。

6.  替代方案:将3中的酚醇上清液移至小分子量透析袋中,在2-8 ℃的1% SDS溶液中透析3次,1000 g离心10 min去除沉淀,上清可直接用于蛋白实验。

(3)从新鲜样品中提取疏水性膜蛋白(Triton X-114去污剂法)

1.  配制疏水性蛋白提取液(非裂解液):1% Triton X-114,150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl,1 mM EDTA,调pH值至8.0备用。

2.  菌液于4 ℃条件下15000 g离心15 min收集菌体;用1 ml 含有5 mM MgCl2 的PBS洗涤3次,最后于4 ℃条件下15000 g离心15 min收集菌体。

3.  菌体沉淀加入1 ml冷提取液,于4 ℃条件下放置2 h,17000 g离心10 min,去除沉淀取上清。

4.  将上述上清中的Triton X-114含量增加到2%,再加入20 mM的CaCl2抑制部分蛋白酶活性,37 ℃条件下放置10 min使其分层。室温下1000 g离心10 min使液相和去污相充分分层。

5.  将液相和去污相分开,分别用10倍体积的冷丙酮在冰上沉淀45 min。

6.  于4 ℃条件下17000 g离心30 min,用去离子水洗涤沉淀3次。

7.  将沉淀溶解在1% SDS溶液中,测定蛋白浓度,比较液相和去污相中蛋白提取效率,一般是去污相中疏水性膜蛋白较多,适于进一步蛋白实验。

8.  SDS-PAGE进一步分析液相和去污相的蛋白图谱。

  



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