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Western blot(WB)

WB是用特异性抗体对PAGE电泳的蛋白质样品进行着色,并通过分析着色的位置和深度来获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息

Protocol

1从细胞中提取蛋白,并测定浓度含量

 

2取适量蛋白液与loading buffer(含有SDS和β-巯基乙醇)混合,加热煮沸5min,使蛋白变性后与SDS结合携带负电。



3将变性蛋白进行SDS-PAGE胶电泳。在电压的作用下,带负电的蛋白质由上向下在凝胶里移动,且蛋白的分子质量越大,其迁移率越慢


4 转膜:通过半干法或湿转法将PAGE胶上的蛋白转移至NC膜或PVDF膜上。

5 免疫印迹:封闭&敷抗体

6 检测方法


免疫共沉淀

免疫共沉淀是利用抗原和抗体的特异性结合及细菌的Protein A或G特异性结合到免疫球蛋白的Fc片段的现象,将靶蛋白从混合体系中沉淀下来。

该实验共包括了3种类型:IP(如染色体免疫共沉淀CHIP)、Co-IP和Pulldown

IP是只利用抗体抗原的特异性结合即可将靶蛋白从混合体系中沉淀下来。其中,CHIP便是由IP技术衍生而来。


Co-IP是在细胞非变性裂解时,蛋白之间的相互作用被保留下来,如果蛋白质X的抗体免疫沉淀X,那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。

 

Pull Down是将靶蛋白的配体固化在亲和树脂上充当一种“诱饵蛋白”,当目的蛋白溶液过柱时,可捕获与之相互作用的目的蛋白,洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分析即可。


免疫组化

免疫组化是应用免疫学及组织化学原理,对组织切片或细胞标本中的某些化学成分进行原位的定性、定位或定量研究

酶联免疫吸附测定ELISA

ELISA是将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上,利用抗原抗体结合专一性进行免疫反应的定性和定量检测方法。

ELISA包括三种类型:间接法、夹心法和竞争性法

间接法(Indirect ELISA)

Protocol:

1 准备样品:样品来源可以是细胞裂解物或是血液中的蛋白混合物,用PBS进行梯度稀释。

2 将稀释好的样品加入96孔板,4℃过夜孵育,进行抗原吸附。

3 孵育后,用PBST清洗3次,以除去孔内没有结合或结合力弱的抗原。

4 用封闭液覆盖没有结合蛋白的微孔表面,37℃孵育2h。避免一抗的非特异性结合

5 封闭液封闭后,用PBST清洗3次,加入稀释好的一抗(高特异性),37℃孵育1h。抗体可按倍数稀释,且每孔做两个或三个副孔。

6 一抗孵育后,用PBST清洗3次后,加入稀释好的连接酶的二抗,37℃孵育1h。

7二抗孵育完后,用PBST清洗3次,加入底物,避光孵育30min,用酶标仪检测OD值。OD值越高,样品中目的蛋白的含量越高。

夹心法(SandwichELISA)

Protocol:

1 准备样品:样品来源可以是细胞裂解物或是血液中的蛋白混合物,用PBS进行梯度稀释。

2 孵育一抗,4℃过夜,将一抗吸附在孔底表面。

3 孵育后,用PBST清洗3次,以除去孔内没有结合或结合力弱的抗体。

4 用封闭液覆盖没有结合抗体的微孔表面,避免抗原的非特异性结合。

5 封闭液封闭后,用PBST清洗3次后,加入样品(抗原),37℃孵育1h。抗体可按倍数稀释,且每孔做两个或三个副孔。

6 用PBST清洗3次后,加入检测抗体,37孵育1h。

7 用PBST清洗3次后,加入酶联抗体,37℃孵育1h。

8 用PBST清洗3次,加入底物,避光孵育30min,用酶标仪检测OD值。OD值越高,样品中目的蛋白含量越高。


竞争性ELISA(competitive ELISA)

Protocol:

1 将抗体和抗原在试管里结合形成复合物。

2 将复合物加入96孔板中,4℃过夜孵育,使其吸附在孔底表面。

3 用PBST洗3次,将没有吸附的蛋白或复合物洗掉。


4 用封闭液覆盖没有结合蛋白的微孔表面,37℃孵育1h。避免二抗的非特异性结合。

5 用PBST洗3次,加入竞争性酶联抗体(可与抗原样品竞争结合一抗),37℃孵育1h。

6 用PBST洗3次,加入底物,避光孵育30min,用酶标仪检测OD值。OD值越小,说明样品中目的蛋白的含量越高。




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