原代细胞的培养与建系

一.原代细胞的定义

    原代细胞（primary culture cell）是指从机体取出后立即培养的细胞。有人把培养的第1代细胞与传10代以内的细胞统称为原代细胞培养。原代细胞不仅广泛应用于分子、细胞生物学和生物医学基础研究，如蛋白质组学、基因组学、细胞株（系）研究、DNA，RNA和遗传学研究等，还可应用于当今热门的生物医药产业如药物筛选、药物代谢和毒理研究、癌症药物的研究等。

二.原代细胞培养
将动物机体中待培养组织从机体中取出，然后用各种消化性酶（如胰蛋白酶）消化，或用机械方法处理，将组织分离成单细胞，最后添加适当的培养基培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。原代培养的细胞由于其和机体细胞在形态结构、功能等方面非常接近，常被用作药理实验重要的研究材料。 
1.所需设备与试剂
超净工作台、细胞培养箱、离心机、离心管、倒置显微镜、普通光学显微镜、吸管、废液缸、培养瓶、平皿、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、水浴锅（37℃）、添加有0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶消化液、RPMI 1640细胞培养基（添加有20％的FBS）、Hank’s液、75%酒精溶液、碘酒等。
培养对象：新生小鼠的肝细胞。
2.操作步骤 
1、胰蛋白酶消化法
（1）将新生小鼠拉颈椎致死，置75%酒精泡2-3秒钟，再用碘酒消毒腹部，用纱布将小鼠包裹后带入超净台内，解剖取肝脏，放入一玻璃平皿中。 
（2）用Hank’s液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物，然后用手术剪将肝脏剪成1mm3大小的组织块，再用Hank’s液洗三次。   
（3）将组织块转移至一小青霉素瓶中，视组织块的多少加入5-6倍体积的0.25%胰蛋白酶消化液，37℃中消化。
（4）待大部分细胞被消化成为单细胞后，加入3-5ml培养液及时终止胰酶的消化作用。
（5）将上述细胞悬液转移至一离心管中，1000rpm，离心5分钟，弃上清液。
（6）加入Hank’s液5ml，重悬细胞，然后重复上一步骤。
（7）加入1-2ml培养基重悬细胞，血球计数板计数细胞密度。
（8）在细胞计数的基础之上，利用培养基将细胞密度调整到5×105个/ml左右，然后将细胞悬液转移（分装）至相应大小的细胞培养瓶中，置细胞培养箱中37℃培养。  
2、组织块法
（1）第1、2步与胰酶消化法相同。
（2）将用Hank’s洗涤后的组织块直接转移到培养瓶，贴附在培养瓶的底面（凹面，生长面）。
（3）将培养瓶翻转，使培养瓶的生长面朝上，然后加入适量培养基至瓶中，应避免培养液与组织块接触。
（4）将培养瓶小心转移至细胞培养箱中，37℃静置2-3小时，然后轻轻翻转培养瓶，使培养瓶的生长面组织浸入培养液中（勿使组织漂起），继续培养。
3、注意事项
（1）自取材开始，保持所有组织细胞处于无菌条件，细胞计数可在有菌环境中进行。
（2）在超净台中，组织细胞、培养液等不能暴露过久，以免溶液蒸发。
（3）75%酒精泡消毒的时间不宜过长，以免酒精从口和肛门浸入体内。
（4） 胰蛋白酶消化的时间长短与组织细胞的幼嫩程度、数量以及酶的活力等因素密切相关，另外在消化过程中应密切观察，及时吹打，避免消化过度。
（5）进行组织块培养时，组织块贴附的时间会因组织类型等的不同有所差异。
（6）待到组织块周围长出单细胞层后将组织块剔除，便可收获细胞或进行传代培养。

三.细胞传代培养      

当细胞在培养瓶长成致密的单层后，通常已经没有足够的生长空间和营养条件满足细胞进一步生长的需求。为使细胞能继续生长，同时使细胞的数量扩大，就必须进行传代再培养。同时，传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法，也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。通常，悬浮型细胞可通过直接补充培养基后再分瓶的方法进行传代，方法相对简单，而贴壁细胞则需经消化后才能分瓶培养。
1.所需设备与试剂
超净工作台、细胞培养箱、离心机、离心管、倒置显微镜、吸管、废液缸、培养瓶、移液管、添加有0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶消化液、RPMI 1640细胞培养基（添加有10％FBS）、Hank’s液等。

2.操作步骤
1、贴壁细胞的传代培养
（1）将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。
（2）加入1-2ml 0.25％胰酶溶液，使所有细胞都能被浸入到溶液中，室温或37℃消化。
（3）利用倒置显微镜或肉眼观察细胞的消化状况。随着时间的推移，原本贴壁的细胞会逐渐变圆，并开始脱落。
（4）待到消化充分后，及时加入10ml Hank’s液终止消化。
（5）用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，转移至一离心管中，1000rpm，离心5分钟，弃上清液。
（6）用10-15ml新鲜培养基重悬细胞，并将其分装到两至三个培养瓶中，37℃下继续培养。
（7）过夜观察细胞的贴壁及生长状况。
2、悬浮生长细胞的传代培养
   悬浮生长细胞的传代培养要比贴壁细胞简单得多，通常有两种方法：
（1）直接给带传代的培养瓶中补充一定量的新鲜培养基，然后将进行分装。
（2）先通过离心弃掉营养匮乏的旧培养基，然后再用适量的新鲜培养基重悬细胞沉淀，最后将其分装至培养瓶中即可。
3、注意事项
（1）传代的比例取决于细胞的生长状态、生长速度以及实验的目的要求等因素，通常按照1：2或1：3的比例进行传代。
（2）避免消化过度。
四、附录 
（一）胰蛋白酶消化液的配制
精确称取0.25克胰酶蛋白酶（活力为1：250），加入100ml不含Ca2+、Mg2+的Hank’s液溶解，滤器过滤除菌，4℃保存。 胰酶溶液中也可加入EDTA，其终浓度为0.02％。
（二）Hank’s液的配制
KH2PO4 0.06g，Nacl 8.0g，NaHCO3 0.35g，KCl 0.4g，葡萄糖1.0g，Na2HPO4·H2O  0.06g，酚红0.02g，加H2O至 1000ml，过滤除菌或高压灭菌，分装后4℃下保存。
（三）血清的灭活与融化
1、血清的灭活方法
（1）将水浴锅的温度设置在56℃，待水温恒定后将血清瓶放入到水浴锅中，勿使瓶子倒置和淹没在水中。
（2）待水温重回56℃后，计时灭活30分钟，每隔10分钟轻轻晃动血清瓶。
（3）无菌分装，-20℃冻存
    注意事项：①灭活时间不要超过30分钟；②灭活后的血清外观会发生改变；
2、灭活后血清的融化
（1）将水浴锅的温度设置在30℃。
（2）从冰箱取出冻存的灭活血清，室温条件下先放置10分钟。
（3）将分装有灭活血清的瓶子放入到30℃水浴锅中，勿使瓶子倒置和淹没在水中。每10分钟轻轻晃动瓶子有助于使其均匀融化并减少沉淀的形成。
（4）待其完全融化后，按一定用量将其加入到相应的培养基中。
注意事项：①有人选择37℃融化血清，但一般而言，温度越高，营养成分降解得越厉害；②灭活后的血清不宜反复冻融。